Citrus Research & Technology
https://citrusrt.ccsm.br/article/doi/10.4322/crt.ICC068
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Article

Study of the relationship between flavonoids content and changes in the enzymes implicated in their biosynthetic pathway, during development of Citrus sinensis cv. Sanguinelli fruits  

Estudo da relação entre o conteúdo de flavonoides e as alterações das enzimas implicadas no processo biosintético, durante o desenvolvimento de frutos de Citrus sinensis cv. Sanguinelli 

Licinio Díaz, Javier Martínez-Nicolás, José Antonio Del Río, Ana Ortuño, Ignacio Porras & Agustín Conesa

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Abstract

Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Sanguinelli is the most common blood orange cultivated in Spain. Flavonoids as hesperidin and naringin are the most important plant secondary metabolites present in Citrus fruits. These are the phenolic compound most predominant in Citrus fruits and juices. Some Citrus fruits, as the blood orange, contain also anthocyanins as cyanidin 3-glucoside, cyanidin 3.5-diglucoside, delphinidin 3-glucoside, peonidin 3-(6”-malonylglucoside), and cyanidin 3-(6”-dioxalylglucoside). These flavonoids have been shown to be antioxidants, free radical scavengers, quenching capacity of singlet oxygen, superoxide anion scavenging activity, and antilipoperoxidant activity. The aim of this study is to deepen in knowledge about changes of main flavonoids and anthocyanins accumulation levels and to study the enzymes that regulate the anthocyanins biosynthesis during the ripening process. The levels of main flavanones and anthocyanins presents in fruits during fruits development have been identified and quantified by HPLC-MS/MS and HPLC-DAD-TOF. Also, transcriptions levels of 6 genes directly implicated in anthocyanins biosynthesis have been study by RT-PCR during this period. The selected genes were (i) chalcone synthase (CHS); (ii) flavonoid-3-hydroxilase (F3H); (iii) dihydroflavonol 4-reductase (DFR); (iv) anthocyanidin synthase (ANS); (v) UDP-glucose-flavonoid-glucosyltransferase UFGT; (vi) glutation-S-transferase (GST). The results show that accumulation of anthocyanins is produced in pulp, starting in October-November (when temperature begins to decrease). During this period, the expression of related genes with the biosynthesis pathway, as ACS, DFR and GST, increase in a significantly way (amounts of 1400, 1800 and 12000 fold expression respectively in contrast to the basal levels). The relationship among flavonoids content and the degree of expression of enzymes implicated in their biosynthetic pathway permits to determine which are the enzymes responsible for control the biosynthesis of these secondary metabolites in Citrus.

Keywords

 cyanidin 3-glycoside, cianidin 3-(6” malonyl glucoside), peonidin 3-(6” malonyl glucoside), hesperidin, chalcone synthase, flavonoid-3-hydroxilase, dihydroflavonol 4-reductase, anthocyanidin synthase, UDP-glucose-flavonoid-glucosyltransferase, glutation-S-transferase.

Resumo

Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Sanguinelli é a laranja sanguínea mais cultivada na Espanha. Os flavonoides hesperidina e a naringina são os metabólitos secundários mais importantes, presentes em frutas cítricas. Estes são também os compostos fenólicos predominantes em frutas cítricas e sucos. Alguns citros, como as laranjas sanguíneas, contêm também antocianinas como cianidina 3-glucosidio, cianidina 3,5-diglucosidio, delfinidina 3-glucosidio, peonidina 3-(6”-malonilglucosidio) e cianidina 3-(6”-dioxalilglucosidio). Estes flavonoides demonstraram ter atuação como antioxidantes, eliminadores de radicais livres, com capacidade de extinguir o oxigênio singlete, ativadores de eliminação de ânions superóxido, além da atividade antilipoperoxidante. O objetivo deste estudo foi aprofundar o conhecimento sobre mudanças nos principais níveis de acumulação de flavonoides e antocianinas, além de estudar as enzimas que regulam a biossíntese de antocianinas durante o processo de amadurecimento. Os níveis das principais flavanonas e antocianinas presentes em frutas durante o desenvolvimento dos mesmos, foram identificados e quantificados por HPLC-MS/MS e HPLC-DAD-TOF. Além disso, os níveis de transcrição de seis genes diretamente implicados na biossíntese de antocianinas foram estudados por RT-PCR durante esse período. Os genes selecionados foram (i) chalcone sintase (CHS); (ii) flavonoide-3-hidroxilase (F3H); (iii) di-hidroflavonola 4-redutase (DFR); (iv) antocianidina sintase (ANS); (v) UDP-glicose-flavonoide-glucosiltransferase UFGT; (vi) glutatione-S-transferase (GST). Os resultados mostram que o acúmulo de antocianinas ocorre na polpa, começando em outubro-novembro (quando a temperatura começa a diminuir). Durante este período, a expressão de genes relacionados com a via de biossíntese, como ACS, DFR e GST, aumenta de forma significativa (quantidades de 1400, 1800 e 12000 vezes de expressão, respectivamente, em contraste com os níveis basais). A relação entre o conteúdo de flavonoides e o grau de expressão de enzimas implicadas na via biossintética permite determinar quais são as enzimas responsáveis pelo controle da biossíntese desses metabólitos secundários em Citrus.

Palavras-chave

 cianidina 3-glicosidio, cianidina 3-(6” malonil glucosidio), 3- peonidina 3-(6” malonil glucosidio), hesperidina, chalcone sintase, flavonoide-3-hidroxilase, di-hidroflavonola 4-redutase, antocianidina sintase, UDP-glucose-flavonoide-glucosiltransferase, glutatione-S-transferase
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